Навіщо застосовують диференціально діагностичні середовища. Диференціально-діагностичні середовища

13.1.3 Зміни середовища застосування або середовища розробки Використання та модифікація раніше розробленого ПЗ можуть включати нове середовище розробки, новий об'єктний процесор або інші апаратні засоби, або інтеграцію з ПЗ, яке відмінно від використовуваного для

Поживним середовищему мікробіології називають середовища, що містять різні сполуки складного чи простого складу, які застосовуються для розмноження бактерій чи інших мікроорганізмів у лабораторних чи промислових умовах.

Поживні середовища готуютьз продуктів тваринного чи рослинного походження. Велике значення має наявність у поживному середовищі ростових факторів, що каталізують метаболічні процеси мікробної клітини (вітаміни групи В, нікотинова кислота та ін.).

Штучні середовищаготують за певними рецептами з різних настоїв чи відварів тваринного чи рослинного походження з додаванням неорганічних солей, вуглеводів та азотистих речовин.

У бактеріологічній практицінайчастіше використовують сухі живильні середовища, які одержують на основі досягнень сучасної біотехнології. Для їх приготування використовують економічно рентабельну нехарчову сировину: втратив термін придатності кровозамінники (гідролізин-кислотний гідролізат крові тварин, амінопептид - ферментативний гідролізат крові; продукти біотехнології (кормові дріжджі, кормовий лізин, виноградне борошно, білколізин). часу, зручні при транспортуванні та мають відносно стандартний склад.

За консистенцієюживильні середовища можуть бути рідкими, напіврідкими, щільними. Щільні середовища готують шляхом додавання до рідкого середовища 1,5-2% агару, напіврідкі - 0,3-0,7% агару. Агар є продуктом переробки особливого виду морських водоростей, Він плавиться при температурі 80-86 ° С, твердне при температурі близько 40 ° С і в застиглому стані надає середовищі щільність. У деяких випадках для одержання щільних поживних середовищ використовують желатин (10-15%). Ряд природних поживних середовищ (згорнута сироватка крові, згорнутий яєчний білок) є щільними.

За цільовим призначеннямсередовища поділяють на основні, елективні та диференціально-діагностичні.

До основнихвідносяться середовища, що застосовуються для вирощування багатьох бактерій. Це триптичні гідролізати м'ясних, рибних продуктів, крові тварин або казеїну, з яких готують рідке середовище – поживний бульйон та щільне – поживний агар. Такі середовища є основою для приготування складних поживних середовищ - цукрових, кров'яних та ін, що задовольняють харчові потреби патогенних бактерій.

Елективніживильні середовища призначені для вибіркового виділення та накопичення мікроорганізмів певного виду (або певної групи) з матеріалів, що містять різноманітну сторонню мікрофлору. При створенні елективних поживних середовищ виходять із біологічних особливостей, які відрізняють дані мікроорганізми від більшості інших. Наприклад, вибіркове зростання стафілококів спостерігається при підвищеній концентрації хлориду натрію, холерного вібріону - в лужному середовищі і т.д.

Диференційно-діагностичніживильні середовища застосовуються для розмежування окремих видів(або груп) мікроорганізмів. Принцип побудови цих середовищ ґрунтується на тому, що різні види бактерій різняться між собою за біохімічною активністю внаслідок неоднакового набору ферментів.

Особливу групу складають синтетичні та напівсинтетичні живильні середовища. До складу синтетичних середовищ входять хімічно чисті речовини: амінокислоти, мінеральні солі, вуглеводи, вітаміни. У напівсинтетичні середовища додатково включають пептон, дріжджовий екстракт та інші поживні речовини. Ці середовища найчастіше застосовують у науково-дослідній роботі та в мікробіологічній промисловості при отриманні антибіотиків, вакцин та інших препаратів.

У останні рокиз метою економії поживних середовищ та прискореної ідентифікації деяких мікроорганізмів (ентеробактерії, стафілококи, стрептококи та ін) застосовуються так звані мікротест-системи (МТС).Вони є полістиролові пластини з лунками, в яких містяться стерильні диференціально-діагностичні середовища. Стерилізацію МТС проводять УФ-опромінення. Мікротест-системи особливо зручні при масових бактеріологічних дослідженнях у практичних лабораторіях.

Запитання №9. Принципи та методи виділення чистих культур бактерій. Характер зростання мікроорганізмів на рідких та щільних живильних середовищах.

Чистою культуроюназивається популяція бактерій одного виду або одного різновиду, вирощена на живильному середовищі. Багато видів бактерій поділяють за однією ознакою на біологічні варіанти - біовари. Біовари, що відрізняються за біохімічними властивостями, називають хемоварами, за антигенними властивостями - сіроварамипо чутливості до фагу - фаговарами. Культури мікроорганізмів одного й того ж виду, або біовара, виділені з різних джерел або в різний час з одного й того самого джерела, називають штамами, які зазвичай позначаються номерами або символами. Чисті культури бактерій у діагностичних бактеріологічних лабораторіях одержують із ізольованих колоній, пересіваючи їх петлею у пробірки з твердими або, рідше, рідкими живильними середовищами.

Колонія євидиме ізольоване скупчення особин одного виду мікроорганізмів, що утворюється в результаті розмноження однієї бактеріальної клітини на щільному поживному середовищі (на поверхні або в її глибині). Колонії бактерій різних видів відрізняються один від одного за своєю морфологією, кольором та іншими ознаками.

Чисту культуру бактерій отримуютьдля проведення діагностичних досліджень – ідентифікації , яка досягається шляхом визначення морфологічних, культуральних, біохімічних та інших ознак мікроорганізму.

Морфологічні та тинкторіальні ознакибактерій вивчають при мікроскопічному дослідженні мазків, пофарбованих різними методами, та нативних препаратів.

Культуральні властивостіхарактеризуються поживними потребами, умовами та типом зростання бактерій на щільних та рідких поживних середовищах. Вони встановлюються за морфологією колоній та особливостями зростання культури.

Біохімічні ознакибактерій визначаються набором конститутивних та індуцибельних ферментів, властивих певному роду, виду, варіанту. У бактеріологічній практиці таксономічне значення мають найчастіше сахаролітичні та протеолітичні ферменти бактерій, які визначають на диференційно-діагностичних середовищах.

При ідентифікації бактерійдо роду та виду звертають увагу на пігменти, що фарбують колонії та культуральне середовище у різноманітні кольори. Наприклад, червоний пігмент утворюють Serratia marcescens, золотистий пігмент - Staphylococcus aureus ( золотистий стафілокок), синьо-зелений пігмент - Pseu-domonas aeruginosa.

Для встановлення біовара(хемовара, серовара, фаготипу) проводять додаткові дослідження щодо виявлення відповідного маркера – визначення ферменту, антигену, чутливості до фанів.

Методи виділення чистих культур бактерій

Універсальний інструментдля посівів є бактеріальна петля. Крім неї, для посіву уколом застосовують спеціальну бактеріальну голку, а для посівів на чашках Петрі – металеві або скляні шпателі. Для посівів рідких матеріалів поряд з петлею використовують пастерівські та градуйовані піпетки. Перші попередньо виготовляють із стерильних легкоплавких скляних трубочок, які витягують на полум'ї як капілярів. Кінець капіляра відразу ж запаюють для збереження стерильності. У пастерівських та градуйованих піпеток широкий кінець закривають ватою, після чого їх поміщають у спеціальні пенали або обгортають папером і стерилізують.

При пересіванні бактеріальної культуриберуть пробірку в ліву руку, а правою, обхопивши ватяну пробку IV і V пальцями, виймають її, проносячи над полум'ям пальника. Утримуючи іншими пальцями тієї ж руки зашморг, набирають нею посівний матеріал, після чого закривають пробірку пробкою. Потім у пробірку зі скошеним агаром вносять петлю з посівним матеріалом, опускаючи її до конденсату в нижній частині середовища, і зигзагоподібним рухом розподіляють матеріал по скошеній поверхні агару. Вийнявши петлю, обпалюють край пробірки та закривають її пробкою. Петлю стерилізують у полум'ї пальника та ставлять у штатив. Пробірки з посівами надписують, вказуючи дату посіву і характер посівного матеріалу (номер дослідження або назва культури).

Посіви «газоном»виробляють шпателем на живильний агар у чашці Петрі. Для цього, відкривши лівою рукою кришку, петлею або піпеткою наносять посівний матеріал на поверхню живильного агару. Потім проводять шпатель через полум'я пальника, остуджують його внутрішню сторону кришки і розтирають матеріал по всій поверхні середовища. Після інкубації посіву утворюється рівномірне суцільне зростання бактерій.

Характер зростання мікроорганізмів на рідких живильних середовищах:

Бактерії, засіяні в певний, але не змінюється об'єм рідкого живильного середовища, розмножуючись, споживають поживні елементи, що надалі призводить до виснаження живильного середовища та припинення зростання бактерій. Культивування бактерій у такій системі називають періодичним, а культуру – періодичною. Якщо ж умови культивування підтримуються шляхом безперервної подачі свіжого живильного середовища та відтоку такого ж обсягу культуральної рідини, то таке культивування називається безперервним, а культура – ​​безперервною.

При вирощуванні бактерій на рідкому живильному середовищі спостерігається придонне, дифузне або поверхневе (у вигляді плівки) зростання культури.

Характер зростання мікроорганізмів на щільних живильних середовищах:

Бактерії, що ростуть на щільних живильних середовищах, утворюють ізольовані колонії округлої форми з рівними або нерівними краями різної консистенції та кольору, що залежить від пігменту бактерій.

Пігмент, розчинні у воді, дифундують у живильне середовищеі забарвлюють її, наприклад синьогнійна паличка (Pseudomonas aeruginosa) забарвлює середу в синій колір. Інша група пігментів нерозчинна у воді, але розчинна в органічних розчинниках. Так, колонії «чудесної палички» мають криваво-червоний пігмент, розчинний у спирті. І, нарешті, є пігменти, нерозчинні ні у воді, ні в органічних сполуках.

Вид, форму, колір та інші особливості колоній на щільному поживному середовищі (культуральні властивості) враховують при ідентифікації бактерій, а також відборі колоній для одержання чистих культур.

У промислових умовах при отриманні біомаси мікроорганізмів з метою приготування антибіотиків, вакцин, діагностичних препаратів та еубіотиків культивування переважно здійснюють у ферментерах за суворого дотримання оптимальних параметрівдля зростання та розмноження культур.

Запитання №10. Способи одержання енергії бактеріями (дихання, бродіння). Типи дихання бактерій.

Дихання, або біологічне окиснення, засноване на окисно-відновних реакціях, що йдуть з утворенням АТФ-універсального акумулятора хімічної енергії Енергія необхідна мікробній клітині для її життєдіяльності. При диханні відбуваються процеси окислення та відновлення: окислення- віддача донорами (молекулами чи атомами) водню чи електронів; відновлення- приєднання водню чи електронів до акцептора. Акцептором водню або електронів може бути молекулярний кисень (таке дихання називається аеробним) або нітрат, сульфат, фумарат (таке дихання називається анаеробним – нітратним, сульфатним, фумаратним).

Анаеробіоз(Від грец. Аег - повітря + bios - життя) - життєдіяльність, що протікає за відсутності вільного кисню. Якщо донорами та акцепторами водню є органічні сполуки, такий процес називається бродінням. При бродінні відбувається ферментативне розщеплення органічних сполук, переважно вуглеводів, в анаеробних умовах. З урахуванням кінцевого продукту розщеплення вуглеводів розрізняють спиртове, молочнокисле, оцтовокисле та інші види бродіння.

Стосовно молекулярному кисню бактерії можна розділити втричі основні групи: облігатні, тобто. обов'язкові, аероби, облігатні анаероби та факультативні анаероби.

Типи дихання бактерій:

· Суворі аероби. Функціонують у присутність Про 2

· Мікроаерофіли. Потребують О 2 меншою мірою.

· Факультативні анаероби. Живуть у присутності Про 2 і без нього можуть дихати кисневими носіями: сульфати, карбонати.

· Облігатні анаероби. Бактерії, що блукають. Для них О 2 отруйний.

· Культура - мікроорганізми, що виросли на живильному середовищі.

· Колонія - скупчення мікробних клітин.

· Чиста культура - мікроби одного виду.

· Клон – генетично однорідна популяція м/о, виділена з однієї мікробної клітини за її прямої ізоляції.

· Штам - чиста культура мікробів виділена з певного джерела у певний час.

Вітамінів у точно встановлених дозах. Як джерела азоту в них використовуються амінокислоти. Перевага цих середовищ у тому, що вони мають постійний склад, за ними можна визначити потреби мікробів у тих чи інших поживних речовинах.

Щільні живильні середовища готують із рідких з додаванням ущільнювача. Як ущільнювач зазвичай застосовують агар-агар. Агар-агар - продукт, що отримується з морських водоростей, є жовтуватим порошком або пластинками, містить високомолекулярні полісахариди, не розщеплюється більшістю мікроорганізмів, не руйнується при автоклавуванні, поживну цінність середовищ не змінює, не пригнічує зростання мікробів. Для імунологічних та бактеріологічних полів використовується виморожений, освітлений агар, який при кип'ятінні або автоклавуванні суміші порошку з водою розплавляється при температурі 85-100 ° С, а при охолодженні до 45-48 ° С утворює гель.

Для приготування щільних поживних середовищ агар-агар додають у концентрації від 1,5 до 3%.

Прості середовища.

М'ясо-пептонний бульйон (МПБ)є білковою основою всіх середовищ.

Існує кілька способів виготовлення МПБ:

а) на м'ясній воді з додаванням готового пептону – це так званий м'ясо-пептонний бульйон;

б) на переварах продуктів гідролізу вихідної сировини за допомогою ферментів (трипсину - бульйон Хоттінгера, пепсину - бульйон Мартена).

Вони зручні при транспортуванні, можуть довго зберігатися, позбавляють лабораторії від величезного процесу приготування середовищ, наближають до вирішення питання стандартизації середовищ. Медична промисловість виробляє сухі середовища Ендо, Левіна, Плоскірєва, вісмутсульфіт агар, поживний агар, вуглеводи з індикатором ВР та інші.

Термостати

Для культивування мікроорганізмів використовують термостати.

Термостат – це апарат, у якому підтримують постійну температуру. Прилад складається з нагрівача, камери, подвійних стінок, між якими циркулює повітря чи вода. Температура регулюється терморегулятором. Оптимальна температура розмноження більшості мікроорганізмів 37°С.

Методика приготування пластинчастого агару

МПА розплавляють на водяній бані, потім остуджують до 50-55°С. Шийка флакона обпікають у полум'ї спиртівки, відкривають чашки Петрі так, щоб увійшло шийку флакони, не торкаючись до країв чашки, виливають 10-15 мл МПА, закривши кришку, похитують чашку, щоб середовище рівномірно розподілилося, залишають на горизонтальній поверхні до застигання. Після підсушування чашки із пластинчастим агаром зберігають на холоді.

Посів петлею

Стерильною остудженою петлею беруть краплю матеріалу, лівою рукою відкривають один край чашки, вносять петлю всередину і в протилежного краю роблять петлею кілька штрихів на одному місці, потім петлю відривають і засівають матеріал паралельними штрихами від одного краю чашки до іншого з інтервалом. На початку посіву, коли мікробів на петлі буде багато, вони дадуть зливне зростання, але з кожним штрихом мікробів на петлі залишається все менше, і вони залишатимуться одиночними і даватимуть ізольовані колонії.

Посів за методом Дригальського

Цей метод використовується при посіві матеріалу, що рясно обсіменений мікрофлорою (гній, випорожнення, мокротиння). Для посіву методом Дригальського беруть шпатель і кілька чашок (3-4). Шпатель- це інструмент, виготовлений із металевого дроту або скляного проводу, загнутого у вигляді трикутника або Г-подібно. Матеріал петлею або піпеткою вносять у першу чашку і рівномірно розподіляють шпателем по поверхні середовища, цим же шпателем, не пропалюючи його, втирають матеріал у живильне середовище у другій чашці, а потім - у третій. При такому посіві в першій чашці буде зливне зростання, а в наступних чашках виростають ізольовані колонії.

Виділення чистої культури за Щукевичем

Для посіву беруть свіжоприготоване живильне середовище з конденсатом. Досліджуваний матеріал забирають петлею і вносять його обережно, дотримуючись правил асептики, не торкаючись середовища та стінок, у конденсаційну воду. Бактерії з високою рухливістю виповзають на вологу поверхню скошеного агару.

В результаті самостійної роботи студент повинен знати:

1. Класифікацію, морфологію грибів, їх методи вивчення.

2. Класифікацію та морфологію актиноміцетів.

3. Правила протиепідемічних режимів та техніки безпеки.

Вміти:

1. Диференціювати мікроорганізми при мікроскопії.

2. Мікроскопувати забарвлені препарати.

3. Знезаражувати матеріал, обробляти руки препаратами, що дезінфують.

4. Приготувати препарати із чистих культур.